底物溶解：根據(jù)實驗需求，將底物用合適的溶劑溶解。通常推薦使用 DMSO（二甲基亞砜）溶解，配制成高濃度的母液（如 1 - 10 mM） 。溶解過程中，使用移液槍準確量取溶劑，加入底物管中，輕輕振蕩或渦旋混勻，確保底物溶解。溶解后的母液分裝成小份， - 20℃或 - 80℃避光保存，避免反復(fù)凍融，以防止底物降解。

緩沖液配制：準備適合蛋白酶活性檢測的緩沖液，緩沖液的選擇需根據(jù)目標蛋白酶的特性確定 。例如，對于大多數(shù)中性 pH 環(huán)境下發(fā)揮活性的蛋白酶，可使用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）；對于酸性蛋白酶，可使用醋酸緩沖液（pH 4.0 - 5.0）等。緩沖液中可能還需添加必要的輔助成分，如金屬離子（某些蛋白酶需要特定的金屬離子激活）、還原劑（防止半胱氨酸蛋白酶的活性中心被氧化）等，具體成分和濃度參考相關(guān)文獻或?qū)嶒灲?jīng)驗。

細胞樣本：若檢測細胞內(nèi)的蛋白酶活性，需收集細胞并制備細胞裂解液 。首先用胰酶消化貼壁細胞，或直接收集懸浮細胞，使用預(yù)冷的 PBS 洗滌細胞 2 - 3 次，去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的細胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液），在冰上裂解細胞 15 - 30 分鐘，期間可輕輕振蕩或渦旋。最后通過離心（如 12000 rpm，4℃離心 10 - 15 分鐘）收集上清液，即為細胞裂解液，可用于后續(xù)實驗。

組織樣本：對于組織樣本，先將組織切成小塊，加入適量的預(yù)冷勻漿緩沖液（如含蛋白酶抑制劑的 PBS），使用組織勻漿器進行勻漿處理 。勻漿后的組織樣本通過離心（如 12000 rpm，4℃離心 15 - 20 分鐘）去除組織碎片，收集上清液作為組織勻漿樣本。

體液樣本：血清、血漿、尿液等體液樣本可直接使用，或根據(jù)實驗需求進行適當?shù)南♂?。若樣本中存在雜質(zhì)或可能干擾實驗的物質(zhì)，可通過離心（如 3000 rpm，室溫離心 10 分鐘）或過濾等方法進行預(yù)處理。

緩沖液：170 μL

樣本（細胞裂解液、組織勻漿、體液等）：20 μL

底物母液（根據(jù)實驗設(shè)計稀釋至合適濃度，如 100 μM）：10 μL

空白對照：加入緩沖液、底物，但不加入樣本，用于檢測底物自身的熒光背景以及實驗過程中的非特異性熒光信號 。

陰性對照：加入緩沖液、樣本，但不加入底物，用于檢測樣本中可能存在的自發(fā)熒光或其他非特異性熒光物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響 。

陽性對照：加入已知活性的蛋白酶標準品、緩沖液和底物，用于驗證實驗體系的有效性和檢測方法的準確性 。陽性對照的蛋白酶濃度應(yīng)根據(jù)實驗需求和標準品的活性進行合理設(shè)置。

標準曲線法：使用已知濃度的蛋白酶標準品，按照上述實驗操作步驟進行檢測，繪制熒光值與蛋白酶濃度的標準曲線 。根據(jù)樣本的校正熒光值，在標準曲線上查找對應(yīng)的蛋白酶濃度，從而計算出樣本中蛋白酶的活性。

相對定量法：若只需要比較不同樣本之間蛋白酶活性的相對差異，可選擇相對定量法 。以某一個樣本作為參照樣本，計算其他樣本與參照樣本的熒光值比值，該比值可反映不同樣本中蛋白酶活性的相對高低。

原因：可能是底物濃度過低、蛋白酶活性低、反應(yīng)時間不足、樣本中存在抑制劑等 。

解決方法：適當提高底物濃度，重新進行實驗；檢查樣本中蛋白酶的活性，如確認蛋白酶是否失活，可通過添加陽性對照進行驗證；延長反應(yīng)時間，觀察熒光信號是否增強；檢查樣本處理過程中是否引入了蛋白酶抑制劑，如緩沖液中是否誤加了過量的抑制劑，必要時更換樣本或調(diào)整緩沖液成分 。

原因：可能是底物濃度過高、樣本中蛋白酶活性過高、反應(yīng)時間過長等 。

解決方法：降低底物濃度，對樣本進行適當稀釋后重新檢測；減少樣本用量或選擇活性較低的樣本；縮短反應(yīng)時間，重新設(shè)置孵育時間進行實驗 。

原因：可能是底物自身純度不高、DMSO 污染、實驗器材污染、緩沖液中存在熒光物質(zhì)等 。

解決方法：檢查底物的質(zhì)量和純度，必要時更換新的底物；使用新開封的 DMSO 配制底物；對實驗器材進行清洗和消毒，或更換新的器材；重新配制緩沖液，確保所用試劑無熒光雜質(zhì) 。

原因：可能是樣本不均勻、操作誤差、實驗條件不穩(wěn)定等 。

解決方法：確保樣本充分混合均勻，對于組織樣本可增加勻漿次數(shù)；規(guī)范實驗操作，減少移液誤差、溫度控制誤差等；保持實驗環(huán)境穩(wěn)定，使用恒溫恒濕設(shè)備，確保每次實驗的條件一致 。